CRISPR-Cas9技术在PRRSV的应用
2013年1月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是指Cas9 蛋白通过sg RNA 靶向识别并定点切割基因组 DNA导致DNA双链断裂（double strand break, DSB），细胞通过非同源末端连接修复机制修复DSB时所引发的切割位点处DNA碱基的插入或缺失。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas9更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。
随着分子技术的不断发展和PRRSV致病机理的逐步解析，利用CRISPR-Cas9 技术培育对PRRSV引起的传染性疾病具有抗性的动物，以及制备PRRSV基因工程疫苗对畜牧业的发展具有重要意义。
图1，PRRSV的病毒囊膜上的多个结构蛋白组成多聚体，并与宿主细胞膜上的CD163受体结合，而且CD163已经被证实是PRRSV的受体。
图2，CD163基因修饰
有研究发现 CD163蛋白结构域scavenger receptor cysteine-rich domain 5（SRCR5）由第 7 外显子所编码，是病毒感染细胞所必需的，而氨基端的4个 scavenger receptor cysteine-rich（SRCR）区域和胞质尾部是非必需的。此外，利用 CRISPR/Cas9技术敲除猪内源CD163基因，其活体攻毒试验结果证明敲除猪具有抵抗1型和2型PRRSV的能力；用人的同源基因 CD163-like的SRCR8区域替换猪CD163的 SRCR5区域，该基因替换猪的活体攻毒试验也发现替换猪具有抵抗1型PRRSV和降低感染2型 PRRSV的能力；单一敲除猪内源CD163的SRCR5结构域，该基因改造猪在细胞水平试验证明，其巨噬细胞具有抵抗1型和2型PRRSV的表型，同时该改造猪在标准饲养条件下生长发育正常。
图3，PRRSV的基因组结构
利用CRISPR-Cas9技术研究PRRSV活病毒载体疫苗是未来PRRSV疫苗的研发方向之一。首先， Nsp2是PRRSV变异最大的非结构蛋白，其高变区域常发生外源基因的插入、基因片段的缺失、碱基序列的变异，比如我国分离代表性毒株HuB、JXA1以及来自美国的MN184的Nsp2基因编码区均含有不同大小氨基酸的缺失,而且PRRSV Nsp2属于免疫显性蛋白，有较强的免疫原性。
其次，PRRSV基因组的另一个特点是相邻ORFs之间存在一定数量的重叠序列,特别的是编码非结构蛋白的ORF1b和编码GP2a蛋白的ORF2之间并无重叠序列，两者之间相差1个核苷酸，这一特性使其成为外源基因插入的较为理想位置,像在ORF1b和ORF2a中插入PCV2的衣壳蛋白（Cap），使PCV2 Cap蛋白以独立亚基因组单元进行转录和表达等等。
另外，ORF7末端和3'UTR起始端可进行一定数量核苷酸的缺失,有研究在N蛋白编码区和3' UTR插入一个TRS6，并插入GFP基因或白细胞介素4（IL-4），其重组病毒在细胞传代过程中保持稳定。将重组病毒免疫猪，发现重组病毒免疫猪比亲本毒株免疫猪血液中的（CD4+CD8+）T细胞和IL-4水平要高，但它却不能显著提高PRRSV疫苗的保护效力。
总之，无论是利用遗传操作技术（CRISPR-Cas9 技术）制备对PRRSV引起的传染性疾病具有抗性的动物，还是制备PRRSV基因工程疫苗都对畜牧业的发展具有重要意义。
作者简介
刘欢欢丨毕业于云南农业大学，硕士研究生学历，现就职于广东永顺生物制药股份有限公司研发部，主要从事猪病疫苗的研发工作。
李嘉爱丨高级兽医师，毕业于北京大学。现就职于广东永顺生物制药股份有限公司研发部，从事主要猪病的研究以及负责高致病性猪蓝耳病疫苗的生产与研发工作。