一、人畜共患病猪链球菌2型菌的生物安全防范
猪链球菌2型菌为兰氏R群的革兰氏阳性球菌，显微镜下呈单个、成对和短链排列；90年代以来广东、江苏、上海和四川等地不断有猪链球菌2型的病例出现，并造成人员的感染死亡。1991年广东省最早报导猪链球菌2型的出现，1998年长江大洪水后，江苏部分地区猪链球菌病爆发，并造成25人感染，14人死亡，经鉴定为猪链球菌2型；2005年四川部分地区爆发猪链球菌2型疫情，造成204人感染，38人死亡。
猪链球菌2型菌是一种条件性的致病菌，在饲养条件差，营养不足，气温高，机体抵抗力低的情况下，极易由皮肤损伤、粘膜感染发病，特征是潜伏时间短、发病急、体温高、易通过血脑屏障，出现昏迷、抽搐等神经症状；死亡快，质检部2型苗效力检验猪攻毒，今天攻，第2天一早就有猪死亡。四川疫情，有的人感染后没及时治疗，24小时死亡。
在农村一般是由猪先发病，人在处理、屠宰病死猪的过程中，带菌的血水再经人的损伤皮肤进入感染发病。因此在农村中第一是要做好猪链球菌2型菌病的防治，搞好猪舍的环境卫生，提高饲料的营养水平，增强猪体的抵抗力；第二是凡是病死猪都要深埋处理，人不吃病死猪肉。
1、猪链球菌病2型灭活疫苗车间菌液制备的生物安全防范
微生物制苗的概念就是：由一个菌种体，经几级放大培养到一个大的反应罐，这一过程无疑是无限制地扩大复制了病原体，也就是扩大了致病菌的危害风险性，车间菌液制备的生物安全防护由此显得非常重要了，不允许有一个员工因感染出事。
A 制备过程中我们必须要做到下列消毒操作规定：
①火焰消毒操作 打开、关闭菌种试管、三角瓶、500ml瓶、15000ml瓶及反应罐取样口等，要用酒精灯、酒精棉球进行火焰控制，一是防止外界的杂菌跑进去，二是杀死散落出来的2型菌。
②喷壶消毒操作 一个工序开始前，要用喷壶喷洒75%酒精（消毒水）消毒双手、操作台面、菌液瓶外表；操作完毕，喷洒酒精（消毒水）消毒双手、操作台面、菌液瓶、工作服前襟。
③碱水NaOH消毒操作 用过的冻干菌种小瓶、活菌计数的吸管等用具，放到装有4%NaOH溶液的胶盆中；反应罐菌液取样时，取样口下要放装有4%NaOH溶液的胶盆，接住取样时漏出的菌液。
④高压柜消毒操作 活菌计数的肉汤小管，纯粹检验、灭活检验、活菌计数的血平皿，菌种培养用过的试管、三角瓶、500ml瓶、15000ml瓶等都要送到高压柜高温高压后才能出负压区。
⑤原位消毒操作 遇到强毒菌液泄漏或器具破裂，当事人要原位不动进行消毒处理，其他人要戴上厚的胶手套（防碎片扎伤手），用盆装好碎片，用毛巾将菌液收集到胶盆里再用NaOH消毒；清理干净的桌面或地面用NaOH溶液消毒；当事人菌液溅到的工作服、鞋喷洒酒精消毒后，再到淋浴间洗澡出去。
以上的消毒操作程序，一是做到了无菌操作，保证了制品的纯粹性，这几年来的制苗菌液培养极少发生污染，更重要的是做好了操作人员人身安全防护的工作。
B 活菌计数操作时，严禁用口吹吸吸管，一定要用胶球套住吸管进行操作。
C 反应罐接种15000ml瓶大种时，操作人员要佩戴防护目镜，以防菌种大瓶加压爆裂伤人。
2、质检部猪链球菌病2型灭活疫苗检验的生物安全防范
猪效力检验时，负压猪舍每天要清除粪便后，用水冲洗干净，防止糠尘的飞扬，粪便用胶袋装好经高压柜消毒后运出。死猪要用胶袋装好经高压柜高压消毒。效力检验结束，不死的免疫猪和对照猪要钝性处死，不流血水，装胶袋后经高压柜高压消毒。空栏后清洗干净，再用消毒水喷洒栏舍消毒。
饲养员、检验员进入负压强毒房，要按要求穿四连体衣、戴口罩、胶手套、穿水鞋进入操作，操作完毕后，淋浴后出负压区，脱下的连体衣经高压柜高压消毒后再出去清洗。
强毒房的污水要经污水处理区的蒸汽罐煮沸消毒后排出。
3、灭活苗车间、质检部平时要备有先锋霉素等抗菌素类药，遇到皮肤损伤、强毒针头扎伤，即时服用。在2型菌培养期间、质检效检猪攻毒期间，遇有发烧、头晕等身体不适，在服用感冒药时要同时服用1~3天的抗生素。如高热不退要马上去医院静脉滴注抗生素。
在玻璃器具破裂损伤皮肤、攻毒过程针头扎伤，要先挤压伤口出些血，然后再用2%碘酒消毒伤口。
二、生物安全的社会效应
1、每批生物制品都要按规程要求做好安全检验、外源病毒检验，在质检部再把好最后一道关，不能让有问题的疫苗发出使用，出现不安全事故，例如1980年原广东生药厂的猪瘟细胞苗，由于制苗的仔猪肾带毒，用于制苗后，监察室安检猪是到农户买的注射过猪瘟疫苗的猪，用来安检无反应，猪瘟细胞苗判安全检验通过，发出使用造成不安全事故，污染了基层猪场环境，造成了不好的社会影响，赔了230万元。
2、生物安全已列入社会治安的政治范畴，国家有关部门严防严重危害人类健康安全的病毒、病菌在社会上散布流传形成疫情，公司已和农业厅签署了有关生物安全的合约。我公司生产和检验强毒菌毒株有人畜共患病的猪链球菌2型、C群C55138、禽流感H5N1,Re-5株、 Re-4株、猪丹毒C43-6、C43-8；动物患病的强毒巴氏杆菌C44-1、C44-8、C48-2、鸭瘟、鸡新城疫、法氏囊、猪繁殖与呼吸征（NVDC-JXA1株）等。因此，我们在平时的制苗和检验的过程中要严格按照GMP文件规定做好菌毒种的管理、做好防止散毒的工作。
三、有关生物安全、菌毒种管理、防止散毒的GMP文件
（1）生产用菌毒种发放管理规程
1 目的：按农业部有关法律、法规规定及生产要求使用有效的合格种子，对生产用菌毒种进行发放管理。
2 范围：适用于所有生产使用的菌毒种。
3 职责；质量管理部门负责发放菌毒种，并监督使用情况。
4 程序：
4.1 菌毒种使用部门领取菌毒种时应填写菌毒种领取单，并有领取人签字和使用部门负责人批准。领取单应填写所有领菌毒种的名称，代号，数量，要求保存期等。
4.2 负责管理菌毒种的人员，认真审核领取单后，在领取单和菌毒种台帐上，应注明其生产用种子处理情况，经质量部门QA签字后发放给领取人。
4.3 领取人领取菌毒种时，应在相关的登记卡（帐）上签字。
（2）生产用菌毒种登记保管规程
1 目的：明确生产用菌毒种登记保管规程的意义，确保菌毒种保管的正常工作；
2 范围：适应于菌毒种的登记保管；
3 职责：QA人员监控管理；
4 程序：
4.1 用于制造和检验制品的菌毒种，由中监所统一编号备案。
4.2 负责菌毒种管理的人员，收到菌毒种后，立即注册登记，应注明收到日期、数量、收到时菌毒种状况，记载名称、株名、历史、来源、特性、用途、编号、批号、菌毒种号、传代冻干日等。各级菌毒种保管应有严密的登记制度，建立总帐及分类帐，并有详细的菌毒种登记卡和档案。
4.3 各种菌毒种必须按规定分别存放在规定条件的容器中，既应有若干个菌毒种盒带锁，将各种菌毒种分别存放，并将盒放在冰箱内保存。菌毒种盒应加封或加锁，并备有详细的分类清单，严防错乱，避免丢失。
生产用菌毒种和检验用菌毒种应分别存放强菌毒种和弱菌毒种亦应分别存放。
（3）生产用种子批制备、鉴定、保管和使用管理规程
1 目的：明确生产用种子批的制备鉴定，保管和使用。
2 范围：适用于生产用种子批的制备保管使用。
3 职责：QA人员负责种子批的使用监督。
4 程序
4.1 凡供兽用生物制品制造与检验用的菌毒种均实行种子批和分级管理制度。种子分三级：原种、基础种子和生产种子。生产种子由生产部门制备、鉴定、和保管。
4.2 基础种子均需进行一定的传代、继代、复壮工作，并制备生产用种子批。
4.3 领取基础种子同时，领取部门应报上种子继代、传代、复壮及种子批生产日程表，QA 人员监督管理种子批的生产。
4.4 制备种子批的原料标准一般应高于生产用原料的标准，或应符合有关规定。
4.5 生产检验用菌毒种的制备应在空气净化的密闭工作室内进行，不同的菌毒种制备不得在同一室内同时操作，同种的强弱毒应分开制备。强菌毒种和人畜共患菌毒种制备，必须在负压工作室内进行，并做好人员防护。
4.6 菌毒种制备的种子批，应有详细的制造记录，鉴定经过和结果鉴定人签字后经主管人审核存档。
4.7 菌毒种制备种子批，应严格按照《兽用生物制品规程》中的生产用菌毒种制备程序逐项进行，应符合规定：
4.7.1 菌毒种繁殖 菌毒种繁殖后，定量分装于瓶中，冷冻保存，注明收获日期、装量、毒种代数等。
4.7.2 菌毒种鉴定
4.7.2.1 病毒含量 按毒种标准进行测定，应符合规定。
4.7.2.2 安全性 按菌毒种标准进行测定，应符合规定。
4.7.2.3 纯净 按毒种标准进行，作细菌、霉菌、支原体和外源病毒等检查，均应符合规定。
4.7.2.4 纯粹 按菌种标准进行，应符合规定。
4.7.2.5 符合以上标准的菌毒种才能作为生产用种子。
4.8 种子批使用应严格按规定进行传代、继代、复壮等，不得超过规定代次。
4.9 生产种子批由使用部门严格管理并应建立严格的登记制度，表明种子名称，代号，制造数量，制造日期，使用日期，使用数量，使用期限等。
（4）生产用种子的销毁管理规程
1目的：对生产使用过期的种子，超代种子，决定处理的种子进行统一销毁管理，确保生产使用合格种子，及防止其他污染。
2 范围：适用于所有决定销毁的各类种子。
3 职责：QA办负责监督销毁种子。
4 程序
4.1生产种子必须按规定使用，如已超过有效期限，则应报告QA办，由负责菌种的管理人员审核，质保助理批准，对照其生产日期，有效期限，使用数量，剩余数量，核实无误则监督销毁或消毒处理。
4.2 销毁的种子批应有详细记录，明确记载，并有使用部门负责人，保管人员，QA人员共同签字存档。
（5）防止散毒管理办法
1 目 的：制定防止散毒管理办法，确保安全生产、质量可靠、保护环境。
2 适用范围：制品生产和质量检验。
3 责 任 者：总经理、生产部、质管部。
4 正 文：
4.1．生物制品的生产区、检验区、办公区与生活区应严格分开，并用绿地相隔离。
4.2．公司区严禁饲养非生产及非试验用的家畜、家禽。严防犬、猫、飞禽、鼠类等进入各工作场所。
4.3．成品、半成品与生产用的实验动物原材料实施分库管理。生产、检验用的冷库、冰箱严禁存放与生产检验无关的物品。
4.4．生产、检验动物要严格管理严防出逃。
4.5．检验用动物的粪便，经高压消毒处理后交环保部门处理。
4.6．生产车间活毒操作区形成的污水应经蒸汽灭菌后排放。检验动物房形成的污水应通过污水处理系统，经沉淀、加化学消毒剂处理，检验合格后排放。
4.7．所有感染疫病死亡的动物须经高压灭菌后，送环保部门处理。安检、效检注射强毒耐过的动物，试验结束后送解剖室宰杀、高温处理后交环保处理。
4.8．弱毒疫苗、灭活疫苗生产车间严格分开；有毒与无毒、灭活前与灭活后的生产操作严格分开；在同一操作区内严禁同时操作两种产品以防交叉污染。
4.9．灭活苗活毒生产区、检验动物房强毒区的空气应经高效过滤后排放。
4.10．生产、检验中产生的废弃物按污物处理程序高压灭菌后交环卫部门处理。
4.11．生产、检验中被污染的器械、容器经灭菌、消毒后回收利用。
4.12．生产、检验要小心操作、严防毒液滴漏。工作结束要及时清理消毒设备和场地。
4.13．生产、检验、动物饲养和其他进入生产检验区的工作人员要严格按人员卫生管理规程更衣、洗手（洗澡）。
4.14．质管部门负责对本办法执行情况的监督。
（6）接种培养岗位标准操作规程
1 目 的：建立接种培养岗位标准操作规程，规范接种培养操作。
2 适用范围：生产部、质管部、生产车间接种培养岗位。
3 责 任 者：生产部负责起草，接种培养工艺员、QA检查员负责执行。
4 正 文：
4．1接种前准备：
4．1．1提前根据生产需要准备好所需用具，如叉管、不锈钢污物处理桶等，放入双扉高压灭菌柜内进行消毒处理。
4．1．2操作人员按进入《万级洁净负压区人员的更衣和卫生规范》严格进行更衣和手部消毒后进入生产负压区。在负压区内带上一次性乳胶手套。
4．1．3进入万级洁净区人员不得化装和佩带任何饰物，不准裸手接触制品，不能裸手操作，不应有可见的创口，如有小创口或感染时，不得进入生产区。
4．1．4将清场合格证正本附入生产记录表。
4．1．5进入万级区人员先用消毒液对操作区内使用设备、操作台等进行清洁消毒。
4．1．6从双扉高压灭菌柜内（在万级区内侧）取出接种用具移入操作间，并放置于“已消毒”标识上。将二级种子、葡萄糖和血清移入操作间。
4．1．7准备5%碘酒棉、75%酒精棉。
4．2接种操作：
4．2．1将确认纯粹及菌数合格的种子和无菌血清, 用1%菌毒净溶液抹擦瓶身，然后将瓶搬到洁净间的百级层流罩下。
4．2．2先用酒精棉把血清瓶的瓶塞消毒一遍，再把高压灭菌好的吸血清管接到经高压灭菌过的2万ml空瓶瓶塞上的钢管上，然后用排气球往瓶外抽气，将血清瓶的瓶塞打开然后将吸血清管放到血清瓶内，往2万ml空瓶中抽入血清。血清加入量为总培养基量的1.5%。
4．2．3 驳管：将空气管接驳在种子瓶瓶塞上的进气钢管上，然后用同样的无菌驳管方法为种子瓶、血清瓶和葡萄糖瓶塞上的出料管接上叉管。
4．3种子接入程序:
4.3．1 用上述的无菌驳管方法依次将打气泵、无菌粗过滤器、无菌细菌过滤器、接好管的种子瓶和血清瓶上的进气管接驳起来。
4．3．2 用上述的无菌驳管方法, 将叉管中的一条分管跟罐体上的进料口接驳好。
4．3．3打开搅拌器的电源，开启搅拌器并设置搅拌速度为20转/分。
4．3．4稍微打开缸内进气管开关,使缸内有小量无菌空气进入，同时完全打开罐体的排气阀门，使缸内气压降至较低的正压。
4．3．5 用打气泵慢慢打气,使种子瓶、血清瓶内无菌空气压力逐渐增大，然后打开罐体进料口阀门,无菌空气经过过滤器过滤，通过控制无菌空气流向，使种子液和血清按设定的顺序加入到反应罐中。接种时反应罐内压维持较低的正压，一边通气搅拌，一边缓慢加入种子液、血清和葡萄糖。
4．3．6 种子液、血清和葡萄糖加入完毕后，立即停止打气，同时关闭罐体进料口阀门、排气口阀门，使缸内压力上升至0.5Mpa，然后关闭罐体进气口阀门，保压培养。
4．4细菌培养 接种后，反应罐内培养液先静止培养1h，然后以35Hz的转速搅拌培养，用37℃恒温循环水保持罐内培养液温度为37℃，培养到第三小时按培养基总量的0.1%加入无菌50%葡萄糖溶液，分别记录0、1、2、3、4、5、6h的温度，培养6小时结束。
4．5完毕，填写生产记录表。
4．6清洁现场：
4．6．1将空瓶、叉管及可回收利用的器械等集中灭菌的不锈钢桶内，将生产中遗弃物装于另一灭菌容器内，放入处理污物的双扉高压灭菌柜内，灭菌消毒后再进行清洗处理。
4．6．2清除桌面或设备表面所有废弃物，然后按消毒规程用经灭菌的不脱纤维的专用擦布浸泡消毒液（0．５%百毒杀灭或75%酒精）清洁消毒工作台面和地面及使用过的设备。
4．6．3填写清场记录，经QA检查员检查合格，在批生产记录上签名。并签发清场合格证，挂“已清场”标记。
4．6．4出负压区，脱下防护衣、内衣、除下口罩，放在指定的位置，淋浴后出负压区。并有最后一位出负压区的操作人员将衣物等送到处理污物的双扉高压灭菌柜内进行消毒后再清洗处理，最后该操作人员同样进行更衣、淋浴后出负压区。
4．6．5出负压区后通知双扉高压灭菌柜的操作人员对柜内的污物等进行消毒处理。
